灰黃霉素提取技術

時間：2025-09-04 22:03:04 生物制藥畢業論文

灰黃霉素提取技術

　　灰黃霉素提取技術

　　【摘要】目的探討超聲波提取灰黃霉素的優化工藝條件。

　　方法用紫外分光光度法(UV)測定灰黃霉素的含量。

　　以灰黃霉素的提取率為評價指標，在單一影響因素考察的基礎上，采用正交實驗確定超聲波提取灰黃霉素的優化工藝條件。

　　結果超聲波提取灰黃霉素的優化工藝條件為：10倍量的丙酮為提取溶劑，功率300W，單次輻射時間3s，間歇時間5s，提取時間40min，灰黃霉素提取率為85.58%。

　　通過驗證實驗表明，本實驗所得工藝條件為優化工藝條件。

　　結論本實驗所得工藝條件可行，具有一定的實際應用價值。

　　【主題詞】灰黃霉素提取技術

　　灰黃霉素(griseofulvin)是1939年從灰黃青霉(Penicillium griseofulvin)培養液中得到的一種含氯代謝產物，1958年開始用于臨床。

　　1960年中國醫學科學院抗生素研究所從我國土壤中得到灰黃霉素的生產菌，并研究試制成功灰黃霉素。

　　灰黃霉素是非多烯類抗真菌抗生素，已廣泛用于治療皮膚及角質層的真菌感染。

　　對紅色發癬菌、斷發癬菌、硫毛發癬菌、小孢子菌和絮狀表皮菌等有抑制作用。

　　臨床用于頭癬、迭瓦癬、皮膚癬及手(足，甲)癬等體表真菌感染，特別對頭癬的療效顯著，國內治愈率在90%以上。

　　灰黃霉素是存在于菌絲體內部的抗生素。

　　目前工業上采用溶劑連續浸泡干菌體的提取方法，溶劑大多為丙酮。

　　考慮到常規提取所需時間較長，提取率較低，溶劑用量較大，本研究探討采用超聲波技術提取灰黃霉素的工藝，利用超聲波的空化作用、熱效應、機械作用破壞菌體細胞壁，使溶劑易于滲透至細胞內，有效成分更多的轉移到溶劑中，達到縮短提取時間，提高提取率的目的。

　　一儀器與材料

　　1 儀器： U�1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司)，ALC210.4型電子天平(德國Sartorius公司)，JY92�2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，HF�2.5B超聲波循環提取器(北京宏祥隆生物技術開發有限公司)。

　　2 材料：灰黃霉素菌體(赤峰制藥集團生產，編號：NI�88)，對照品(中華制藥廠產品，純度為99.8%)，丙酮(天津市博迪化工有限公司)，95%乙醇(沈陽化學試劑廠)，氯仿(天津市博迪化工有限公司)，所用試劑均為分析純。

　　二實驗方法

　　1 標準曲線的制備：精密稱取灰黃霉素對照品25mg，25ml丙酮溶液定容，配制標準溶液(初始濃度1.0mg/ml)。

　　精密量取標準溶液2ml于25ml容量瓶，用95%乙醇定容。

　　取丙酮2ml置于25ml容量瓶中，95%乙醇定容，作為空白溶液。

　　紫外光譜200～400nm全波長掃描，在326nm處有最大吸收峰。

　　2 灰黃霉素含量測定：稱取灰黃霉素菌體(含水<5%)1.0g置于250ml燒瓶中，加入丙酮50ml，磁力攪拌回流提取三次，每次1h。

　　測得菌體中灰黃霉素含量為30.67%。

　　3 灰黃霉素超聲波提取影響因素考查： (1)超聲提取溶劑文獻報道灰黃霉素易溶于二甲基甲酰胺、二氯乙烷(以上溶解度約為10%～12%w/v)，可溶于丙酮、氯仿、乙醇(在丙酮中溶解度為5.0%，氯仿為4.4%，乙醇為1.66%)，不溶于水和石油醚。

　　考慮到二甲基甲酰胺價格較高，二氯乙烷毒性較大，本實驗主要選取丙酮、氯仿及95%乙醇為超聲提取溶劑。

　　稱取灰黃霉素菌體5g，共3份，分別用丙酮、氯仿、95%乙醇50ml溶解，超聲條件設定為：功率400W，單次輻射時間3s，提取時間40min，室溫下進行提取，分別測定灰黃霉素溶液的吸光度，提取率分別為83.71%、78.69%和28.95%。

　　由于丙酮對灰黃霉素的提取率較高，因此本實驗選取丙酮作為超聲提取溶劑。

　　(2)溶劑用量稱取灰黃霉素菌體5g，共6份，分別用4、8、10、12、16、20倍量丙酮溶解，超聲波條件不變。

　　分別測定灰黃霉素溶液的吸光度，計算提取率。

　　溶劑4倍量時，提取液中結晶析出太多，故舍去該實驗點。

　　如Fig.1所示，在溶劑倍量為16時有最大提取率。

　　考慮到用較少的溶劑得到較高的提取率，本實驗確定溶劑倍量為10。

　　(3)超聲波提取功率稱取灰黃霉素菌體5g，共3份，分別用丙酮50ml溶解，超聲波條件設定為：功率分別為200、300和400W，單次輻射時間3s，提取時間40min，室溫下進行提取。

　　分別測定灰黃霉素溶液的吸光度，計算提取率。

　　如Fig.2所示，在超聲功率為300W時有最大提取率。

　　(4)超聲波提取時間稱取灰黃霉素菌體5g，用丙酮50ml溶解，超聲波條件設定為：功率400W，單次輻射時間3s，間歇時間5s，室溫下進行提取。

　　從提取時間20min開始，每10min取樣一次，測定灰黃霉素溶液的吸光度，計算提取率。

　　如Fig.3所示，在提取時間為40min時有最大提取率。

　　4 正交實驗：在單一影響因素考察的基礎上，確定以10倍量丙酮為提取溶劑，選取超聲波功率、單次輻射時間、提取時間作為考察指標，采用四因素三水平L9(34)的正交試驗對灰黃霉素的超聲波提取工藝進行優化。

　　根據K值確定灰黃霉素超聲波提取的優化工藝條件為：功率300W，單次輻射時間3s，提取時間40min。

　　根據R值判斷，各因素對實驗結果的影響大小順序為B>A>C。

　　5 優化工藝的驗證實驗：按優化工藝條件重復3次實驗進行驗證，結果灰黃霉素的收率平均值為85.58%，表明實驗所確定的工藝條件為優化工藝條件。

　　6 超聲波循環提取實驗：超聲波循環提取器中加入丙酮2200ml(10倍)，開啟攪拌轉子，調節轉速為1000r/min。

　　緩慢加入菌體220g，待料液完全循環后，開啟超聲波發射器，按正交實驗確定的優化工藝條件(功率300W，單次輻射時間3s，提取時間40min)進行實驗，所得提取率為87.65%，略高于驗證實驗所得提取率。

　　循環放大實驗表明該優化工藝條件可應用于灰黃霉素提取。

　　三結論

　　本研究通過正交設計實驗，對灰黃霉素的超聲波提取工藝條件進行了優化。

　　確定了超聲波提取灰黃霉素的優化工藝條件為：10倍量的丙酮為提取溶劑，功率300W，單次輻射時間3s，提取時間40min。

　　驗證實驗所得提取率為85.58%，超聲波循環放大提取實驗所得提取率為87.65%，表明了該優化工藝條件應用于灰黃霉素的提取是可行的。

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