HPLC法測定益肝靈片中水飛薊賓的含量
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【摘要】 目的 建立測定益肝靈片中水飛薊賓含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Dikma Diamonsid C18柱，甲醇?1%冰醋酸(體積比49∶51)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長288 nm，柱溫為30 ℃。結果 水飛薊賓的質量濃度在20.68～82.72 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系，r=0.999 9;平均回收率為97.5%，RSD為2.8%。結論 本文方法簡便、快速、準確可靠，可用于益肝靈片的質量控制。
【關鍵詞】 益肝靈片;水飛薊賓;高效液相色譜法
益肝靈片為保肝藥，主要成分為水飛薊素，屬于黃酮類化合物，由水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊丁3種同分異構體組成[1]。現行國家標準采用紫外分光光度法，以水飛薊賓計算益肝靈片中水飛薊素的含量，測定結果是水飛薊素(總黃酮)的含量[2]，結果受顏色變化等因素影響較大，并不能準確測定水飛薊賓的含量。為進一步評價益肝靈片的質量，本文建立了益肝靈片中水飛薊賓含量測定的高效液相色譜法，并與紫外分光光度法進行比較。本文方法具有分離效果好、靈敏、準確等優點，可用于該產品的質量控制。
1 儀器與試藥
DIONEX高效液相色譜儀(戴安公司)，UVD170U型可變波長檢測器,P680A四元梯度泵, Chromeleon化學工作站;紫外分光光度計(日立U3210);SK7200H型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器廠)，工作頻率59 kHz，輸出功率350 W。
水飛薊賓對照品(中國藥品生物制品檢定所，0856-200203)，益肝靈片(廣州白云山制藥總廠，批號：4050001，4060001，070303，規格：38.5 mg/片)。甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為高純水。
2 方法與結果
2.1 溶液的制備
2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥3 h后的水飛薊賓對照品約10.34 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(質量濃度為206.8 μg·mL-1)。
2.1.2 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于水飛薊賓10 mg)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;精密吸取上清液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。
2.1.3 陰性對照液的制備 根據處方配制陰性對照品，按“2.1.2”項方法處理得陰性對照液。
2.2 測定方法 由于水飛薊賓對照品和供試品中都同時含有水飛薊賓和異水飛薊賓，因此按外標法以水飛薊賓與異水飛薊賓峰面積之和計算。
2.3 色譜條件及系統適用性試驗
色譜柱為Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司);流動相：甲醇?1%冰醋酸溶液(體積比49∶51);流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：288 nm ;柱溫：30 ℃。分別取對照品溶液(水飛薊賓質量濃度為12 μg·mL-1)、供試品溶液和陰性對照溶液20 μL注入色譜儀，理論板數以水飛薊賓計算應不低于4000;水飛薊賓的拖尾因子為0.94，保留時間約為25 min，水飛薊賓和異水飛薊賓與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5;陰性樣品不干擾樣品測定，見圖1。
2.4 方法學考察
2.4.1 標準曲線的制備 分別吸取一定量的水飛薊賓對照品貯備液，加甲醇稀釋成水飛薊賓質量濃度為20.68、31.02、41.36、51.70、62.04、82.72 μg·mL-1的溶液。依次進樣20 μL，每個濃度測定3次以上。以峰面積(A)對對照品溶液質量濃度(ρ)進行回歸，得水飛薊賓回歸方程為A =667.95ρ+0.11，r=0.999 9。表明水飛薊賓質量濃度在20.68～82.72 μg·mL-1之間與峰面積線性關系良好。
2.4.2 精密度試驗 取質量濃度為41.36 μg·mL-1的水飛薊賓對照品溶液20 μL，連續測定5次，其峰面積的RSD值為2.0%，表明儀器精密度良好。
2.4.3 穩定性試驗 取供試品溶液(批號：070303)在0、2、4、6、8、12、24 h 分別進樣20 μL，記錄峰面積，結果峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在24 h內穩定。
2.4.4 重復性試驗 取同一批號(批號：070303)樣品6份，照“2.1.2”方法處理并測定，結果水飛薊賓平均含量為 6.45 μg·mL-1，RSD為1.5%，表明分析方法精密度良好。
2.4.5 加樣回收試驗 精密稱取同一批號樣品(批號：070303)共6份，精密加入水飛薊賓對照品，照“2.1.2”方法處理并測定，計算回收率，結果水飛薊賓平均回收率為97.5%，RSD為2.8%，表明本方法準確可靠，見表1。表1 水飛薊賓回收率試驗結果
2.5 樣品測定
取益肝靈片3批，照“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液(12 μg·mL-1)與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算樣品中水飛薊賓的含量，結果見表2。表2 樣品中水飛薊賓測定結果
3 討 論
3.1 最大吸收波長的選擇
取對照品溶液在200～400 nm范圍內進行掃描，結果在288 nm處有最大吸收，故確定檢測波長為288 nm，見圖2。
3.2 流動相的選擇
曾試用甲醇?0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液(0.2 moL/L磷酸調節pH值4.0)[3]、甲醇?0.02%冰醋酸溶液[4]和甲醇?1%冰醋酸溶液[5]為流動相，并比較不同比例流動相對分離的影響，結果以甲醇?1%冰醋酸溶液(體積比49∶51)為流動相時的峰形較好，分離度較高。
3.3 提取時間的考察
考察超聲提取10、15、20、25、30 min對提取率的影響，結果表明，超聲提取20 min含量達穩定，時間增加，含量不會增加。因此選擇甲醇為溶劑，超聲提取20 min。
3.4 2種含量測定方法比較
理論含量根據原料水飛薊素的含量和理論投料量計算得出。原料水飛薊素的含量測定方法包括紫外分光光度法測定水飛薊素(總黃酮)含量，結果以水飛薊賓計算，不得少于68%;以及高效液相色譜法測定水飛薊賓的含量，結果含水飛薊賓和異水飛薊賓不得少于30%。2種方法測定結果比較可見，紫外分光光度法測定益肝靈片中水飛薊素以水飛薊賓計，實際是測定總黃酮的量，結果容易受到各種因素影響而出現偏差，相比之下，采用HPLC法對益肝靈片中水飛薊賓進行含量測定的結果更準確。見表3。表3 2種含量測定方法結果比較 批號紫外分光光度法測定含量理論含量HPLC法測定含量理論含量405000138.538.516.517.0406000142.438.517.717.607030337.338.516.816.5
注：理論含量=原料水飛薊中水飛薊賓的含量×理論投料量
【參考文獻】
[1] 周霞，萬軍，吳純潔，等.水飛薊素制劑的研究概況[J].時珍國醫國藥，2006，17(1)：112.
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