超聲照射對人胚腎細胞凋亡的影響

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超聲照射對人胚腎細胞凋亡的影響

　　超聲照射對人胚腎細胞凋亡的影響

　　【摘要】目的了解診斷超聲照射對體外培養的人胚腎(HEK?293)細胞凋亡的影響。

　　方法 HEK?293細胞用腹部超聲探頭(3.5 MHz、MI 0.8)照射0、10、20、30 min，再作Hoechst 33258染色，觀察細胞凋亡的變化。

　　結果超聲照射10 min后，細胞凋亡率與假照組比較差異無統計學意義(P>0.05);超聲照射20 min后，細胞凋亡率明顯高于假照組(P<0.05)，其中以照射30 min較為顯著(P<0.01)。

　　結論特定劑量的超聲照射可誘導人胚腎細胞凋亡增加。

　　【關鍵詞】超聲;凋亡;形態學

　　Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK?293) cells. Methods HEK?293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0, 10, 20 and 30 min, and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group, apoptotic rate of HEK?

　　293 cells increased significantly after 20?min exposure (P<0.05), especially after 30?min exposure (P<0.01). However, there was no statistical difference in apoptotic rate between 10?min exposure group and control group (P>0.05).Conclusion The dose of dia?gnostic ultrasound exposure can induce the apoptosis of HEK?293 cells.

　　Key words:ultrasound; apoptosis; morphology

　　超聲應用于產科，可以推算胎齡、診斷先天畸型及了解胎兒宮內發育情況，它能為胎兒、胚胎甚至正在發育成熟的卵泡提供一個清晰的圖像，同時也需要更高的超聲輸出功率。

　　隨著孕前卵泡檢測和產前檢查越來越細致和精確，超聲運用的頻率、時間、輸出功率也在不斷增加，敏感的胚胎組織及生殖細胞受到的威脅也隨之加大。

　　人們對超聲使用的安全性也越發關心。

　　有關產科超聲的安全性，目前尚無統一定論，更無具體的輻照劑量可引起哪方面的影響這樣的規律可循，孕期超聲檢查只能盡可能地使用最低劑量。

　　這使超聲的產前檢查安全性的遵循原則帶有盲目性，或者引起因不了解超聲的安全范圍而濫用超聲，為產前檢查帶來隱患。

　　要明確知道產前超聲的安全范圍還需要一個漫長的過程，本實驗擬探討超聲近距離輻照對體外培養細胞凋亡形態學改變的影響，為產前超聲的安全使用提供一定的理論依據。

　　1 材料和方法

　　1.1 試劑

　　Hoechst 33258購自美國Sigma公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，其余試劑為國產分析純。

　　HEK?293細胞株由廣東醫學院生化教研室提供。

　　1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258儲存液，密封避光，4℃短期保存。

　　1.2 儀器

　　MCO?15A CO2細胞培養箱(日本SANYO公司)，YJ?875DA 醫用凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)，IMT?I型熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(GE公司)。

　　1.3 細胞培養與處理

　　HEK?293細胞采用常規培養方法，無血清饑餓培養調整細胞周期一致后進行實驗。

　　將細胞分成超聲照射0 、10、20、30 min組，空白組予以假照，腹部探頭產科診斷條件(3.5 MHz、MI 0.8)，介質為細胞培養液(主要成分為DMEM培養基)，輻照距離<1 cm，處理后繼續培養24h后檢測。

　　1.4 細胞染色與觀察

　　收集處理后的細胞，PBS洗滌離心2次后取10μL細胞懸液滴于蓋玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，棄去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體。

　　加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，搖床輕搖，染色10 min，棄去染色液，用熒光顯微鏡避光拍照，激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。

　　1.5 結果評判

　　細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

　　由兩位病理學技術人員對圖片進行分析對照。

　　1.6 凋亡百分率的計算

　　把載波片置于24孔板培養細胞，細胞爬片，調整周期及分組照射(方法同1.3)后培養24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，熒光顯微鏡觀察。

　　計算每孔5個高倍(×400)視野平均細胞總數、凋亡細胞數，最終算出細胞凋亡百分率。

　　1.7 統計學處理

　　計量數據以(±s)表示，使用SPSS10.0統計軟件進行處理，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析及q檢驗。

　　2 結果

　　2.1 HEK?293細胞體外培養

　　HEK?293體外培養成功，經傳代培養后，待細胞生長疏密適中，于倒置相差顯微鏡下進行放大倍數為600倍拍照，光鏡下HEK?293細胞的形態呈多角形，貼壁生長，細胞間有連接，細胞核圓形或橢圓形，大小約占整個細胞的1/3，核內染色質及核仁清晰，部分可見分裂相。

　　2.2 凋亡細胞Hoechst 33258染色的形態學變化

　　空白組：超聲處理0 min(假照)，細胞核大小較一致，核膜完整，核內染色質呈小點狀均勻分布，部分可見有絲分裂相，未見異型核，見圖1。

　　1組：超聲處理10 min，細胞核形態尚規則，核膜完整，未見異形核，但對比空白組，本組細胞核部分出現大小不一，核內染色質聚集的現象，見圖2。

　　2組：超聲處理20 min，細胞核大小不均，一部分細胞核脹大，染色質邊集，一部分細胞核縮小濃染，呈小顆粒狀，個別細胞核膜不完整，染色質疏松，表現為凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改變，見圖3。

　　3組：超聲處理30 min，細胞核大小不均，部分可見異形核的出現，部分細胞核內染色質濃染邊集，呈小團塊狀，個別核膜破裂染色質疏松分布于胞質中，表現為凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改變，見圖4。

　　圖1圖2圖3圖4

　　圖1 空白組細胞Hoechst 33258染色結果(×600);圖2 超聲照射10 min組細胞Hoechst 33258染色結果(×600);

　　圖3 超聲照射20 min組細胞Hoechst 33258染色結 (×600);圖4 超聲照射30 min組細胞Hoechst 33258染色結果(×600)。

　　2.3 細胞凋亡率比較

　　詳見表1。

　　3 討論

　　細胞凋亡是多細胞有機體為保持自身組織穩定、調控自身細胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞主動性死亡過程。

　　細胞凋亡的主要特點為：細胞體積小，染色質濃縮，呈塊狀致密染色區，DNA分子被特異性DNA內切酶在核小體間切斷，核裂解，形成凋亡小體[1]。

　　生殖細胞、受精卵和胚胎組織中，即便是個別細胞出現異常的凋亡，都有可能對其生長發育造成影響。

　　因此超聲對細胞凋亡的影響受到學者們的關注。

　　bcl?2是一種重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究證明，長時間連續超聲照射可引起胎鼠腎小管上皮表1 不同劑量的超聲作用HEK?293細胞凋亡百分率的改變細胞bcl?2蛋白表達水平下降。

　　p53基因在誘導神經細胞凋亡時有重要的作用，趙晶等[3]研究表明，超聲輻照時間和劑量的增加可引起p53基因的蛋白表達水平增加。

　　何明生等[4]發現，電壓為10 mV條件下超聲輻照K562細胞10 min以上，輻照組細胞形態變化較大，核染色質濃縮呈斑塊狀，并有核碎裂、凋亡小體出現。

　　有學者發現低頻超聲輻照HL?60后細胞膜空隙率增加，這可能是凋亡前的形態學改變[5]。

　　Lagneaux等[6]則認為低頻超聲效應與聲化學機制有關，超聲誘導的聲化學冷光能觸發光敏感性單態氧的產生，從而對細胞產生一個“氧化應激”，繼而啟動細胞凋亡反應。

　　一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況，常用的DNA特異性染料有Hoechst 33258，它能與DNA非嵌入式結合，主要結合在A?T堿基區，紫外光激發時發射明亮的藍色熒光，從而對細胞核進行形態學的觀察。

　　Hoechst 33258凋亡染色法具有直觀，方便的優點，并可通過形態學的變化對其凋亡的早中晚期進行估測。

　　本實驗用Hoechst 33258對空白組和處理組細胞染色后，經熒光顯微鏡觀察，與凋亡形態的標準相符合，其中超聲處理30 min組部分細胞核染色質高度凝聚、邊緣化并產生了凋亡Ⅱb期的形態學改變，部分細胞核呈異形核，細胞核形態改變最明顯，細胞凋亡比例最高(P<0.01)。

　　而超聲處理20 min組的細胞，部分出現了凋亡Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣和Ⅱa期染色質濃縮的狀態，也出現了一定數量的凋亡細胞(P<0.05)，說明超聲的長時間聚焦照射可以對細胞產生一定的傷害。

　　從本實驗結果來看，達到或超過20 min的超聲照射可以引起HEK?293細胞部分凋亡及凋亡前期的形態改變。

　　【參考文獻】

　　[1] Vaux D L. Toward and understanding of the molecular mechanism of physiological cell death [J]. PNAS, 1993, 90(3): 786?789.

　　[2] 周海燕, 段云友, 楊繼慶. 彩色多普勒超聲照射對中孕胎鼠腎小管上皮細胞bcl?2蛋白表達的影響[J]. 中國醫學影像技術, 2004, 20 (5): 683?685.

　　[3] 趙晶，段云友，賈化平. 晚孕期彩超重復照射對胎鼠中樞神經P53蛋白表達及超微結構的影響[J]. 中國醫學影像技術, 2005, 21(5): 1169?1171.

　　[4] 何明生, 曹紅花, 朱念麟, 等. 超聲誘導K562細胞凋亡機制的研究[J]. 中國超聲醫學雜志, 2006, 22(10): 724? 726.

　　[5] Ogawa K, Tachibana K, Uchida T, et al. High?resolution scanning electron microscopic evaluation of cell?membrane porosity by ultrasound[J]. Med Electron Microsc, 2001, 34(4): 249?253.

　　[6] Lagneaux L, de Meulenaer E C, Delforge A, et al. Ultrasonic low?energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells[J]. Exp Hematol, 2002, 30(11): 1298?1301.

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