枸杞多糖對大鼠腰椎間盤退變影響的形態學

枸杞多糖對大鼠腰椎間盤退變影響的形態學

　　枸杞多糖對大鼠腰椎間盤退變影響的形態學

　　【摘要】 目的　探討枸杞多糖(LBP)對大鼠退變腰椎間盤的形態學的影響。

　　方法　將健康雄性SD大鼠42只，隨機分為假手術組、椎間盤退變組、LBP干預組，每組14只。

　　采用手術方法制作大鼠腰椎間盤退變模型，LBP干預組在造模后4周，每天上午8：00灌胃給藥，80mg?mL-1，容量為1mL?kg-1，連續4周。

　　假手術組及椎間盤退變組分別給予等容量生理鹽水灌胃，連續4周。

　　在造模后8周三組所有大鼠再次麻醉，取出椎間盤組織，分別在光鏡及電鏡下觀察椎間盤形態學的變化。

　　結果　HE染色光鏡觀察假手術組髓核細胞豐富，形態不規則，集中成簇;椎間盤退變組髓核細胞稀少，細胞基質見大量的空泡;LBP干預組髓核細胞有變性、壞死，但較椎間盤退變組退變程度減輕。

　　電鏡下假手術組的髓核細胞多見，核膜完整，細胞器豐富;椎間盤退變組髓核細胞減少，細胞器缺失，見大量的空泡;LBP干預組髓核細胞減少，有變性、壞死，退變較椎間盤退變組減輕。

　　結論　LBP可能對大鼠腰椎間盤髓核組織退變有延緩作用。

　　【關鍵詞】 腰椎間盤;退變;枸杞多糖

　　腰椎間盤退行性變(Intervertebral Disc Degeneration，IVDD)是導致下腰痛和神經痛的主要原因[1-2]。

　　椎間盤退變是個復雜的病理過程，引起退變的確切原因尚不清楚。

　　目前研究的關注點在于如何尋找有效的藥物或生物制劑抑制細胞因子或炎癥介質，從而延緩或抑制椎間盤退變的發生、發展。

　　實驗證實[3-4]椎間盤退變表現為一系列組織形態學上的變化。

　　觀察用藥后椎間盤組織形態學的變化，可驗證藥物或生物制劑對椎間盤組織的作用。

　　本實驗采用枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)作為干預劑作用于腰椎間盤組織退變的大鼠，并通過組織形態學的觀察以驗證其對椎間盤退變組織的影響。

　　1　材料與方法

　　1.1　實驗動物

　　選取雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠42只，購于寧夏醫科大學實驗動物中心，體重400～476g，動物合格證號：SCXK(寧)2005-0001。

　　1.2　藥品及試劑

　　LBP溶液(寧夏啟元藥業公司生產的粉劑，批號：GF03002-l，純度58.56%)，使用前用生理鹽水配制80mg?mL-1新鮮溶液。

　　1.3　方法

　　1.3.1　實驗動物分組

　　隨機將大鼠分為假手術組(14只)、椎間盤退變組(14只)和LBP藥物干預組(14只)。

　　1.3.2　大鼠腰椎間盤退變造模

　　采用陳德勝等[5]建立大鼠腰椎間盤退變模型的方法，以6.5%的水合氯醛(購于寧夏醫科大學總醫院制劑中心)0.055mL?kg-1腹腔注射麻醉SD大鼠無菌條件下沿腰背部棘突做后正中切口，切開皮膚后，沿骨膜下剝離，充分顯露L1～6棘突、關節突及椎板。

　　咬骨鉗去除棘突、關節突、棘上、棘間韌帶，切斷雙側豎棘肌，依層縫合皮下筋膜、皮膚。

　　假手術組SD大鼠僅切開皮膚后即縫合。

　　1.3.3　LBP藥物干預方法

　　LBP藥物干預組在造模后4周，每天上午8：00灌胃給藥，容量為1mL?kg-1，連續4周。

　　假手術組及椎間盤退變組分別灌胃給予等容量生理鹽水，連續4周。

　　在大鼠腰椎間盤退變模型建立8周后三組所有大鼠再次麻醉，顯露腰椎間盤，迅速取出L3～4或L4～5椎間盤組織。

　　1.4　光學顯微鏡下觀察

　　三組大鼠椎間盤組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，脫水、石蠟包埋、組織切片(厚4～5μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察椎間盤髓核組織的形態學變化。

　　1.5　電子顯微鏡下觀察

　　迅速將切除的椎間盤組織先置于2%戊二醛溶液固定，2 h后，待髓核的蛋白組織徹底變性、凝固后再切取髓核組織，0.1M二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次，每次間隔2 h之后固定過夜。

　　1%鋨酸固定，乙醇、丙酮逐級脫水，環氧樹脂812包埋，超薄切片經檸檬酸鉛染色后，在日立H-600型透射式電子顯微鏡下觀察并攝片。

　　2　結果

　　2.1　光學顯微鏡下觀察結果

　　2.1.1　假手術組

　　可見較多的髓核細胞和不定型的基質，細胞形態不規則集中成簇，細胞質染色深，細胞外的基質豐富，細胞周圍含水量較明顯，膠原纖維排列整齊，見圖1-A(封2)。

　　2.1.2　椎間盤退變組

　　髓核細胞數目減少，細胞內出現空泡，細胞周圍基質較多，細胞含水量減少，同時出現大量的空泡，膠原纖維環排列紊亂，見圖1-B(封2)。

　　2.1.3　LBP藥物干預組

　　髓核細胞出現不同程度的數目減少和形態變化，髓核細胞有變形、壞死 ，見圖1-C(封2)。

　　與椎間盤退變組相比，髓核細胞數目及細胞外基質較多，空泡數目較少。

　　2.2　電子顯微鏡下觀察結果

　　2.2.1　假手術組

　　髓核細胞有突起，細胞核多呈卵圓形或圓形，核膜完整，染色體位于細胞核中央。

　　細胞質內粗面內質網多并排列整齊，可見生長良好的線粒體和高爾基體，細胞漿內有大量的糖原顆粒，見圖2-A(封2)。

　　2.2.2　椎間盤退變組

　　可見壞死的髓核細胞，死亡的細胞外周出現增厚的組織，密度較高。

　　少見的髓核細胞出現空泡變性，核內染色質凝集，核膜不完整，細胞質內細胞器稀少。

　　粗面內質網、高爾基體空泡狀，線粒體腫脹、崩裂或空泡化。

　　嚴重者細胞器分辨不清，胞漿基質密度加深、整個細胞體積縮小。

　　有的細胞呈凋亡改變，胞質模糊不清，胞膜不完整或缺如。

　　細胞質內被大量的空泡填充，見圖2-B(封2)，部分細胞出現不同程度的凋亡改變。

　　2.2.3　LBP藥物干預組

　　髓核細胞可見突起和皺褶，體積雖有縮小但大于造模組，細胞核有變形，染色質出現排列異常，但形態較規則。

　　細胞器依稀可見，有的模糊不清，胞膜欠完整。

　　有的可見細胞質內的線粒體，但線粒體內嵴樣結構觀察欠清晰。

　　細胞質電子密度低的空泡明顯少于椎間盤退變組，見圖2-C(封2)。

　　3　討論

　　隨著我國老齡化社會的到來，機體退變性的病變如椎間盤退變引起的脊柱疾患日益構成對人民健康的威脅，并嚴重影響其生活質量。

　　采取有效的藥物或生物制劑延緩或抑制椎間盤退變的發生、發展一直是近年來脊柱外科研究的熱點。

　　椎間盤髓核細胞及纖維環在維持內環境穩定性及修復椎間盤退變的過程中起著至關重要的作用[6]。

　　本實驗的大鼠椎間盤退變模型是通過改變脊柱生物力學，使得椎間盤穩定性失衡，從而椎間盤出現退行性改變。

　　椎間盤的組織形態學改變與椎間盤退變發生、發展密切相關。

　　實驗證實：椎間盤退變表現為一系列組織形態學上的變化[3-4]。

　　光學顯微鏡下觀察，正常的椎間盤組織可見髓核細胞分布在髓核中，細胞增殖活躍，膠原纖維排列整齊。

　　隨著年齡的增長發生漸進性的退行性改變，表現為細胞減少，組織結構紊亂的程度逐漸加重，膠原纖維增生、粗大、走行紊亂[7]。

　　本實驗研究的假手術組、可見較多的髓核細胞和不定型的基質，細胞形態不規則集中成簇，細胞外的基質豐富，膠原纖維排列整齊。

　　而椎間盤退變組與上述正常椎間盤組織形態和椎間盤自然退變的形態學變化相符合。

　　LBP藥物干預組為髓核細胞出現不同程度的數目減少和形態變化，髓核細胞有變形、壞死。

　　此組光學顯微鏡下的病理改變介于上二組之間，說明LBP可能對椎間盤退變有延緩作用。

　　從根本上而言，退變椎間盤的變化在于自身細胞的功能退化、凋亡和壞死。

　　通過超微結構的觀察，以明確椎間盤退變發生、發展的相關程度。

　　正常的椎間盤組織超微結構表現為髓核細胞胞膜外有突起，核膜完整，染色體位于細胞核中央。

　　細胞質的細胞器表現為大量密集的呈扁平囊狀的粗面內質網及其間的一些多聚核糖體和單個核糖體。

　　線粒體數量多，呈板狀或管狀嵴。

　　膠原纖維在正常間盤排列緊密，呈波浪狀。

　　而發生退變的椎間盤會出現相應的變化。

　　劉勇等[8]電鏡下觀察突出椎間盤組織，發現細胞胞質中的線粒體數量少或看不清，粗面內質網減少，嚴重退變細胞中溶酶體、空泡和微絲增多，壞死細胞中細胞器空化。

　　這些都是細胞功能衰退的征象，并與退變的程度相關。

　　Helen等[9]電鏡下觀察不同年齡階段椎間盤膠原纖維的波紋發現，膠原纖維在正常間盤排列緊密，呈波浪狀，而在退變間盤中排列稀疏和折皺。

　　本實驗電子顯微鏡下觀察結果與上述文獻報道比較吻合，證實了通過手術方法建立的大鼠腰椎間盤退變模型[5]椎間盤超微結構的改變與椎間盤退變程度相關。

　　LBP藥物干預組為髓核細胞出現不同程度的數目減少和形態變化，髓核細胞有變形、壞死。

　　此組超微結構的病理改變介于假手術組和椎間盤退變組之間，進一步驗證了LBP可能具有延緩椎間盤退變的作用。

　　本文通過光鏡和電鏡觀察了LBP對大鼠退變的椎間盤髓核組織形態學的影響，驗證了LBP可能有延緩或抑制椎間盤退變的作用，為尋找預防、治療椎間盤退變的藥物提供了實驗依據。

　　【參考文獻】

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　　[2]　Smith LJ，Nerurkar NL，Choi KS，et al.Degeneration and regeneration of the intervertebral disc：lessons from development[J]. Dis Model Mech,2011,4(1)：31-41.

　　[3]　Ergün T，Lakadamyal H，Sahin MS.The relation between sagittal morphology of the lumbosacral spine and the degree of lumbar intervertebral disc degeneration[J].Acta Orthop Traumatol Turc,2010,44(4)：293-299.

　　[4]　Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain[J].Rheumatology (Oxford),2009,48(1)：5-10.

　　[5]　陳德勝，金群華，李燕，等.一種大鼠腰椎間盤退變模型的建立[J].中華實驗外科雜志，2006,23(4)：625-626.

　　[6]　王鋒，王運濤，吳小濤.髓核細胞修復椎間盤退行性變的研究進展[J].中圍修復重建外科雜志，2009,23(7)：864-867.

　　[7]　王連榮，宋紅星，王菊光，等. 人體椎間盤自然退變的形態學變化[J].中國矯形外科雜志，2002,9(5)：488-491.

　　[8]　劉勇，胡有谷，陳曉亮.不同病理類型椎間盤突出組織的超微結構觀察[J].中國脊柱脊髓雜志，2003,13(7)：416-418.

　　[9]　Helen EG，Edward NH.Observations on morphologic changes in the aging and degenerating human disc[ J]. BMC Musculoskelet[J].Disord,2002,3(1)：9.

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