葡萄糖鉗夾技術的建立
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【摘要】 目的： 建立能精確測定胰島素敏感性的高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術. 方法： 應用高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術對10名正常體質量、正常糖耐量的健康志愿者進行方法學研究. 結果： 鉗夾試驗開始后，血漿胰島素濃度迅速上升并維持在100 mU/L左右，空腹血糖維持在正常水平(5.0 mmol/ L)，試驗過程中內源性胰島素和肝糖源輸出得到完全抑制，血液升糖激素濃度 (包括皮質醇和生長激素) 與基礎值相比無明顯上升. 鉗夾穩態期，葡萄糖輸注率為 (11.56±1.74) mg/(kg·min). 結論： 高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術已成功建立. 在高胰島素?正常葡萄糖穩態條件下，葡萄糖輸注率等于機體的葡萄糖利用率，葡萄糖輸注率可以作為評價組織對外源性胰島素敏感性的指標.
【關鍵詞】 胰島素 葡萄糖鉗制技術 胰島素抗藥性 胰島素敏感性
引言
高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術 (hyperinsulinemic?euglycemic clamp) 是目前世界上公認評價機體胰島素敏感性的金標準，已在基礎及臨床醫學研究領域中得到廣泛應用，并且已擴展應用于許多病理狀態、藥物或非藥物防治措施的機制研究中. 建立和開展高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術對于糖尿病基礎和臨床研究具有重要意義，但由于此方法操作復雜、價格昂貴且費時，國內僅有數家醫院開展此技術. 我院內分泌科自2006年引進葡萄糖鉗夾系統以來，根據DeFronzo等[1]所建立經典鉗夾技術的原理并結合國內外近年來的研究進展，成功建立了高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術.
1對象和方法
1.1對象10 (男5，女5)名正常健康志愿者，年齡27.0 ± 4.4 (23~37)歲，體質量指數20.3 ± 1.2 (19.2~23.2) kg/m2，無糖尿病、高血壓病家族史，血脂譜正常，肝、腎功能及血尿酸濃度均在正常范圍，未服用任何可能影響胰島素敏感性的藥物，口服75 g葡萄糖耐量試驗均為正常糖耐量者 (按2003年ADA標準). 試驗前3 d受試者每日碳水化合物飲食不少于200 g，體質量保持穩定. 試驗前向受試者解釋試驗的性質、目的及可能發生的不良反應，所有受試者均自愿參加試驗并簽署知情同意書.
1.2方法受試者檢查前空腹12 h，早8:00到達檢查室，測量身高、體質量，排空小便后清醒靜臥于檢查床30 min后開始試驗. 先分別于受試者雙側前臂行靜脈穿刺，利用三通管組成2條靜脈通道. 一側用于輸注胰島素及200 mL/L葡萄糖液 (連接于Injectomat C?IS和INCA?ST容積泵，德國Fresenius公司);另一側用于試驗中采血 (將此側前臂置于60℃恒溫儀中，以保證靜脈血動脈化[2])，不采血時緩慢靜滴生理鹽水，采血前臨時關閉輸液器.
鉗夾開始10 min內以4 mU/(kg·min)速率輸注人胰島素溶液 (諾和靈R，40000 U/L，丹麥Novo Nordisk公司) 使血液胰島素濃度迅速升高，隨后110 min內以2 mU/(kg·min)速率持續輸注. 在此期間每5 min測一次靜脈血糖值 (BIOSEN5030血糖分析儀，葡萄糖氧化酶電極法，德國)，根據血糖值調整200 mL/L葡萄糖液輸注率，使受試者血糖值維持在5.0 mmol/L左右. 每10 min采靜脈血測定血清胰島素濃度，每30 min測定血清C肽、皮質醇和生長激素濃度 (化學發光法，藥盒購自天津德普診斷產品有限公司). 試驗結束時收集試驗期間尿標本，測定尿糖值 (測定方法同血糖測定). 所有血標本均經離心分離血清，-80℃冰箱保存至同批測定.
統計學處理： 試驗結束后計算各受試者試驗中血糖值均數(x)、標準差(s)及變異系數(CV)，計算試驗中每10 min的平均葡萄糖輸注率(glucose infusion rate, GIR)、機體總葡萄糖利用率 (鉗夾開始 20~120 min內平均GIR) 和最大葡萄糖利用率 (鉗夾穩態期最后30 min平均GIR). 全部數據均采用SPSS 13.0軟件處理，計量資料以x±s表示，不同性別之間比較采用兩獨立樣本t檢驗.
2結果
全部受試者均成功完成鉗夾試驗，檢查結束后均未發生低血糖反應及其他異常反應，靜脈穿刺部位未發生感染及靜脈血栓形成. 結果顯示高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術成功建立.
2.1外源性胰島素?葡萄糖代謝穩態形成基礎血漿葡萄糖濃度為 (4.26±0.39) mmol/L，在高胰島素?正常葡萄糖鉗夾過程中，血糖穩定在 (4.99±0.15)mmol/L，穩態期血糖CV為 (3.09±1.29)%. 基礎血清胰島素濃度為 (3.81±2.20) mU/L，鉗夾試驗開始后血清胰島素濃度迅速升高，于10 min時達到高峰 (133.70±21.91)mU/L，隨后維持在 (91.57±13.86)mU/L 至試驗結束. 基礎血清C肽濃度為(1.92±0.34)μg/L，整個鉗夾過程中C肽濃度為 (1.32±0.35)μg/L，各個時點的C肽濃度與基礎狀態相比呈逐漸下降趨勢 (圖1). 鉗夾穩態期與基礎狀態相比較，升糖激素如血皮質醇、生長激素的濃度無明顯上升，且均呈逐漸下降的趨勢 (圖2).
2. 2高胰島素?正常葡萄糖鉗夾過程中的血糖及葡萄糖輸注率變化鉗夾試驗過程中受試者血糖濃度穩定在 (4.99±0.15)mmol/L，試驗開始40 min內GIR上升較快，達到 (9.45±3.17)mg/(kg·min)，此后上升趨于平緩，在90~120 min時均保持在穩態 (圖3). 鉗夾開始20~120 min內GIR為 (10.75±2.38)mg/(kg·min)，穩態期GIR為 (11.56±1.74)mg/(kg·min)，不同性別之間GIR [男 (10.53±1.57)mg/(kg·min)，女 (12.25±1.59)mg/(kg·min)] 差異無統計學意義(P=0.12).
3討論
1966年Andres依據糖代謝特點設計了高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術，1979年DeFronzo等[1]對該技術作了詳細研究并應用于人體，從此推動了葡萄糖鉗夾技術在世界范圍內的應用，成為目前公認評價機體胰島素敏感性的“金標準”. 本研究按照DeFronzo等[1]的方法進行設計，結果顯示形成穩定高胰島素狀態，達到完全抑制肝臟內源性葡萄糖輸出的目的;血糖鉗夾在正常水平，變異系數小于5%;試驗中內源性胰島素分泌被抑制，升糖激素無明顯釋放，符合高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術成功建立的標準[1]. 正常人體內胰島素濃度高于生理水平時肝糖輸出可以被完全抑制，故鉗夾試驗中當達到高胰島素穩態時外源性葡萄糖輸注率 (GIR) 等于外周組織的葡萄糖利用率 (M值)，此時GIR可作為評價機體胰島素敏感性的指標[1]. 賈偉平等[3]建立擴展高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術時穩態期胰島素濃度為(63.00±4.86) mU/L時肝糖產生為0，故計算M值時可忽略肝糖的產生. 當對存在胰島素抵抗的患者進行正常葡萄糖鉗夾試驗時，經典試驗中采用的胰島素輸注率所達到的穩態期胰島素濃度并不能完全抑制肝糖輸出[4].
研究表明，無論是糖尿病患者還是其他胰島素抵抗嚴重的患者，當采用較快的胰島素輸注率使穩態期胰島素濃度達到200 mU/L以上時，肝糖輸出幾乎被完全抑制，可以避免肝糖輸出影響試驗結果[5- 6]. 本組10名受試者鉗夾試驗時均采用2 mU/(kg·min)的胰島素輸注率，穩態期胰島素濃度與DeFronzo經典試驗結果類似[1]. 不同實驗室采用相同胰島素輸注率時穩態期胰島素濃度相差較大，可能與試驗具體操作、胰島素測定方法及受試者空腹胰島素濃度不同等因素有關. 鉗夾穩態期胰島素濃度不同，GIR值也不同，一般穩態期胰島素濃度越高，GIR值越大[1, 3, 7-10]. 當對存在胰島素抵抗的患者進行正常葡萄糖鉗夾試驗時，穩態期胰島素濃度較高，評價胰島素敏感性時可采用穩態期胰島素濃度加以較正[11].
綜上所述，高胰島素?正常葡萄糖鉗夾試驗中達到胰島素?葡萄糖代謝穩態后的外源性葡萄糖輸注率等于外周組織的葡萄糖利用率，葡萄糖輸注率 (GIR) 可作為評價機體胰島素敏感性的指標. 近年來鉗夾試驗中微量精確輸液泵和計算機技術的應用大大簡化了試驗操作難度并提高了成功率，高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術將在糖尿病的預測、糖尿病發病機制研究等方面發揮重要作用.
【參考文獻】
[1] DeFronzo RA, Tobin JD, Andres R. Glucose clamp technique: A method for quantifying insulin secretion and resistance [J]. Am J Physiol, 1979, 237 (3): E214-E223.
[2] Abumrad NN, Rabin D, Diamond MP, et al. Use of a heated superficial hand vein as an alternative site for the measurement of amino acid concentrations and for the study of glucose and alanine kinetics in man [J]. Metabolism, 1981, 30 (9): 936-940.
[3] 賈偉平，陳蕾，項坤三，等. 擴展高胰島素?正葡萄糖鉗夾技術的建立 [J]. 中華內分泌代謝雜志, 2001, 17 (5): 268-271.
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